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怎么使用EXCAVATOR2檢測(cè)WES的CNV，針對(duì)這個(gè)問題，這篇文章詳細(xì)介紹了相對(duì)應(yīng)的分析和解答，希望可以幫助更多想解決這個(gè)問題的小伙伴找到更簡(jiǎn)單易行的方法。
讓客戶滿意是我們工作的目標(biāo)，不斷超越客戶的期望值來(lái)自于我們對(duì)這個(gè)行業(yè)的熱愛。我們立志把好的技術(shù)通過有效、簡(jiǎn)單的方式提供給客戶，將通過不懈努力成為客戶在信息化領(lǐng)域值得信任、有價(jià)值的長(zhǎng)期合作伙伴，公司提供的服務(wù)項(xiàng)目有：申請(qǐng)域名、網(wǎng)絡(luò)空間、營(yíng)銷軟件、網(wǎng)站建設(shè)、東風(fēng)網(wǎng)站維護(hù)、網(wǎng)站推廣。
excavator2是一款利用WES數(shù)據(jù)進(jìn)行CNV分析的軟件，其他同類軟件通常只關(guān)注捕獲的exon區(qū)域，而該軟件則進(jìn)行了延伸，將捕獲區(qū)域劃分為exon和非exon區(qū)域兩部分，在校正測(cè)序深度的分布時(shí)對(duì)這兩部分區(qū)域分別分別進(jìn)行處理，對(duì)應(yīng)的文章發(fā)表在Nucleic Acids Research上，鏈接如下
https://academic.oup.com/nar/article/44/20/e154/2607979
該軟件的源代碼保存在sourceforge上，鏈接如下
https://sourceforge.net/projects/excavator2tool/
excavator2在計(jì)算測(cè)序深度時(shí)將reads分為了以下兩個(gè)部分
in-target reads
off-target reads
in-target表示的是位于exon上的序列，off-target表示的是位于基因間區(qū)或者內(nèi)含子區(qū)的序列，同樣采用了滑動(dòng)窗口的方式來(lái)統(tǒng)計(jì)每個(gè)區(qū)域的測(cè)序深度，只不過稍作變化，全稱如下
mean windows read count
簡(jiǎn)稱WMRC, 計(jì)算公式如下
單個(gè)外顯子直接作為一個(gè)窗口，而非外顯子區(qū)域則采用了一個(gè)固定長(zhǎng)度的窗口，分開統(tǒng)計(jì)不同區(qū)域的測(cè)序深度，并進(jìn)行校正，校正的時(shí)候考慮了GC含量，不同區(qū)域的mappability, 外顯子的大小等因素。
利用歸一化之后的測(cè)序深度，計(jì)算對(duì)照樣本和實(shí)驗(yàn)樣本的log2 ratio值，然后采用HSLM segmentation算法劃分segment, 最后通過FastCall算法預(yù)測(cè)每個(gè)segment的拷貝數(shù)情況，細(xì)分為以下5種
two-copy deletion
one-copy deletion
normal
one-copy duplication
multiple-copy duplicaiton
該軟件支持hg19和hg38兩個(gè)版本，內(nèi)置了對(duì)應(yīng)的數(shù)據(jù)庫(kù)，示意如下
該軟件分成了3個(gè)模塊，對(duì)應(yīng)3個(gè)腳本，具體操作步驟如下
1. TargetPerla.pl
提供一個(gè)捕獲區(qū)域的bed文件，計(jì)算in-target和off-target區(qū)域的GC含量，mappability值，用于后續(xù)的歸一化操作，用法如下
perl TargetPerla.pl \
SourceTarget.txt \
myTarget.bed \
MyTarget_w50000 \
50000 \
hg19第一個(gè)參數(shù)為source target文件，該文件記錄了基因組對(duì)應(yīng)的bw文件和fasta文件的路徑，內(nèi)容示意如下
/data/ucsc.hg19.bw /data/hg19.fasta
空格分隔的兩列，第一列為bw文件的路徑，該文件是軟件自帶的，位于軟件的安裝目錄，用于計(jì)算基因組不同區(qū)域的mappability，第二列為fasta文件的路徑，用于計(jì)算不同區(qū)域的GC含量。
第二個(gè)參數(shù)為捕獲區(qū)域的bed文件，第三個(gè)參數(shù)為輸出結(jié)果的前綴，第四個(gè)參數(shù)為窗口的固定長(zhǎng)度，第五個(gè)參數(shù)指定基因組的版本。
這一步類似于比對(duì)時(shí)建立參考基因組的索引，一個(gè)芯片建立一次即可，運(yùn)行成功后，會(huì)生成一個(gè)文件夾，前綴為MyTarget_w50000。
2. EXCAVATORDataPrepare.pl
計(jì)算測(cè)序深度，進(jìn)行歸一化處理，用法如下
perl EXCAVATORDataPrepare.pl \
ExperimentalFile.txt \
--processors 6 \
--target MyTarget_w50000 \
--assembly hg19第一個(gè)參數(shù)是一個(gè)空格分隔的txt文件，指定了樣本對(duì)應(yīng)的bam文件，輸出結(jié)果的路徑，樣本名稱信息，內(nèi)容示意如下
--processors指定并行的線程數(shù)，--target參數(shù)指定第一步生成的target的名稱，--assembly指定參考基因組的版本。
3. EXCAVATORDataAnalysis.pl
執(zhí)行HSLM segmentation算法和FastCall算法，進(jìn)行CNV分析，用法如下
perl EXCAVATORDataAnalysis.pl \
ExperimentalFileAnalysis.txt \
--processors 6 \
--target MyTarget_w50000 \
--assembly hg19 \
--output Results_MyProject_w50K \
--mode pooling--mode參數(shù)表示樣本如何進(jìn)行比較，支持pooling和paired兩種模式，第一種模式將所有的實(shí)驗(yàn)樣本混合與對(duì)照樣本進(jìn)行比較，第二種模式則是配對(duì)樣本模式，比如癌和癌旁，兩兩之間進(jìn)行比較，計(jì)算log2 ration值。
第一個(gè)參數(shù)ExperimentalFileAnalysis.txt是一個(gè)空格分隔的txt文件，指定了樣本的比較操作，對(duì)于pooling模式，其內(nèi)容示意如下
對(duì)于paired模式，其內(nèi)容示意如下
T表示Treat, C表示Control, 后面的數(shù)字用于區(qū)分不同樣本。
--output指定了輸出結(jié)果的目錄，輸出結(jié)果中提供了CNV區(qū)域?qū)?yīng)的txt, VCF等文件，同時(shí)還提供了可視化的結(jié)果，示意如下
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